材料和方法

2.1.材料

2.1.1.藜麥粉

（Chenopodium quinoa Willd.）由"Cooperativa Las Nieves"（智利VI地區(qū)）提供。面粉在4℃下儲存直至使用。

2.1.2.殼聚糖

殼聚糖薄膜（Qo）。殼聚糖膜(Qo)脫乙酰度為88.5%的脫乙酰度為88.5%的殼聚糖膜(Qo)來自蟹殼的NMR-H1和600 kDa的Mwn，購自SigmaeAldrich,USA(C48165)。

殼聚糖納米顆粒低分子量殼聚糖Qo(QoLMW)購自SigmaeAldrich,Inc.(St.Louis,MO,USA,C448869)，具有以下特性：比濃粘度(hsp/c)?203(mL/g)，粘度平均值摩爾質(zhì)量(Mv)=269 kDa，通過NMR-H1測量的脫乙酰度為78.3%（Lavertu等，2003）。特性粘度在0.1 M乙酸(HOAc)+0.2 M NaCl中以25℃測定。粘均分子量通過使用該溶劑中的MarkeHowink常數(shù)確定，K 1/4 1.81E?03 mL/g，a 1/4 0.93（Rinaudo,Milas,&Le Dung,1993;Tapia,Montezuma,&Yazdani-Pedram,2008）.

2.1.3.細菌菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 25923（金黃色葡萄球菌）；大腸桿菌ATCC 25922（大腸桿菌）；銅綠假單胞菌ATCC 27853（銅綠假單胞菌）；S.enterica serovar Typhimurium ATCC 14028(S.typhimurium);產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048（產(chǎn)氣腸桿菌）；和Listeria innocua ATCC 33090(L.innocua)從Instituto de Salud Pública,Santiago,Chile獲得，用于抗菌活性測試。

2.2.印膜準備

2.2.1.EPQ的準備

EPQ根據(jù)Abugoch等人的方法制備。(2011)和Valenzuela等人。(2013)。藜麥粉懸浮在蒸餾水(18 g/100 mL)中，并用1 M NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11。懸浮液在室溫下攪拌60分鐘，然后在21,000?g 15℃30分鐘。根據(jù)布拉德福德方法（Bradford，1976）測量可溶性蛋白質(zhì)含量并表示為蛋白質(zhì)毫克數(shù)/毫升。EPQ是在每次需要時在使用前準備的。

2.2.2.Qo解決方案的制備

制備由1.5和2 g/100 mL Qo的檸檬酸(0.1 M)組成的溶液。將溶液超聲30分鐘（Fisher Scientific FS30H，德國）并在4℃下儲存過夜以消除氣泡。溶液在4℃下儲存直至使用。

2.2.3.膠片準備

Qo薄膜由高分子量和高粘度Qo（1.5%和2.0%w/v檸檬酸在0.1 mol/L中）制成。將這些溶液(48.5±0.1 g)澆鑄在低密度聚乙烯（直徑1/4 8.5 cm）板上。在50℃下將薄膜干燥至恒重。從1.5%w/v的Qo溶液中獲得的薄膜的表面固體密度為0.013 g固體cm-2次方。

Qo和EPQ的共混物是通過將在pH 11(6.7%w/v)和Qo（1.5%和2.0%w/v檸檬酸的0.1 mol/L）下獲得的EPQ溶液以不同的Qo/EPQ比率（90:10、80:20、70:30、60:40和50:50%v/v)。將混合物的pH值調(diào)整為3.0（Valenzuela等人，2013年）。成型和干燥如對Qo所述進行。小心地從板上取下干燥的薄膜，并在測試前在22℃和60%的相對濕度下調(diào)節(jié)3天。從Qo/EPQ比為90:10的Qo(1.5%w/v)和EPQ混合獲得的薄膜的表面固體密度為0.011 g固體cm?

2.2.3.NP制備

NQ是按照Calvo、Remu~n?an-L?opez、Vila-Jato和Alonso(1997)描述的程序制備的。在0.1 M檸檬酸中制備0.3%(w/v)QoLMW溶液并攪拌24小時。TPP制備的終濃度為1.0 mg/mL。將Qo溶液（輸液泵KDS200，KD Scientific©）以2:1(v/v)TPP:Qo的比例逐滴加入TPP溶液(1.8 mL/min)并在室溫下劇烈磁力攪拌（Calvo等等，1997）。所得懸浮液在21,000?g以14度離心30分鐘（HermLe model Z32K，Wehingen，Germany）。

根據(jù)上述相同程序制備負載Th的Qo NPs(NQoThs)。制備Th(Sigma,USA,CT0501)溶液（0.1 M檸檬酸中的0.1%(w/v)）并將其添加到QoLMW溶液中。將Qo/Th溶液滴加到TPP溶液中。

2.4.NQoThs的油墨配方

使用兩種不同的油墨配方將納米顆粒印刷到可食用薄膜上。根據(jù)Buanz等人的方法，通過將4.4±0.1 mg/mL NQoThs以20%或30%(v/v)分散在甘油中制備含有NQoTh薄膜的墨水。(2011)。將油墨分散體超聲處理(Fisher Scientific FS30H)30分鐘并在環(huán)境溫度下儲存直至使用。

2.5.NP的表征

2.5.1.Zeta電位、PDI和粒子流體動力學直徑

Zeta電位、PDI和粒子流體動力學直徑使用Zetasizer Nano ZS-20（Malvern儀器）在4.0mW和633 nm下操作，固定散射角為173度，在25度下測量。在毛細管樣品管內(nèi)包含的NQos和NQoThs的10 mL溶液（20%和30%甘油，w/v）中評估樣品。

2.5.2.粘度測量

使用Ostwald U型管粘度計（B號，Technico，英國）在溫控水浴（25冷凝）（Grant Instruments Ltd.，Cambridge，UK）中測量粘度。蒸餾水用作參考。

2.5.3.表面張力測量

用Kibron微張力計（Kibron Inc.，F(xiàn)inland）使用50 mL樣品溶液測量表面張力。該儀器用蒸餾水作為參考進行校準（表面張力?72.8 mN m1次方，25負降溫）（Buanz等，2011）。

2.5.4.透射電子顯微鏡(TEM)

飛利浦Tecnai 12 Bio Twin透射電子顯微鏡用于觀察納米顆粒的形態(tài)。將一滴納米顆粒分散體涂在涂覆的銅網(wǎng)上，然后在室溫下干燥，然后進行TEM分析。

2.5.5.接觸角

基于滴落法(Kwok&Neumann,1999)評估Qo和Qo/EPQ薄膜上NQoTh分散體的接觸角測量值(n=10)。用微量移液管(Gilson Pipetman U2)形成NQoTh分散體的小液滴(2.0 mL)。在將液滴放置在薄膜上30秒后，使用光學系統(tǒng)獲取液滴的圖像。光學系統(tǒng)由連接到CCD相機（Pulnix,Inc.,San Jose,CA,USA）的變焦視頻鏡頭（Edmund Optics，NJ，USA）組成，使用ImageJ軟件（美國國立衛(wèi)生研究院，美國）與插件Drop Shape Analysis(Drop-analysis,2011)。

2.6.使用NQoThs制作電影

所有實驗均使用未經(jīng)修改的Deskjet 4000k210熱噴墨打印機（HewlettePackard Inc.）進行。黑色墨盒（型號HP 675，cn690A）通過切掉頂部，去除泡沫墊，用蒸餾水沖洗掉墨水，然后用無水乙醇沖洗掉。墨盒裝有20 mL的NQoTh分散體，以印刷在Qo和Qo/EPQ薄膜上。打印模板為Word 2007（微軟公司）編制的8.8*8.8平方厘米的面積。打印設(shè)置適用于提供的最高分辨率的黑色墨盒（600 dpi提供180 pL/drop，HewlettePackard Inc.，2012，Pagewide技術(shù)）。每次使用后，用蒸餾水和無水乙醇沖洗小柱（Buanz等，2011）。NQoThs由TIJ印刷在膠片上。該方法包括三個步驟。第一個是通過添加20%和30%(w/v)的甘油制備NQoThs的水分散體，這會減少溶質(zhì)的結(jié)晶，防止打開鎖定的打印頭（Buanz等人，2011年），以及修改液體的表面張力和粘度（Khan等人，2010年；Kipphan，2001年）以確保NQoTh分散體作為微滴的適當遞送。第二步和第三步包括將分散體放置在改進的打印頭中，并將分散體打印在Qo和Qo/EPQ薄膜上。

對于Qo薄膜，印刷面積為77.44平方厘米，厚度為0.02厘米，印刷體積為1.56立方厘米。為此，使用了HewlettePackard 4000k210型打印機。打印參數(shù)是顏色選擇（黑色墨水）和最大分辨率（600 dpi），這允許傳送體積為180 pL的墨滴（HewlettePackard Inc.，Pagewide技術(shù)）。含20%和30%甘油的NQoThs的儲備分散體中Th的初始濃度分別為120.15和105.13 ppm。

2.7.印刷Th的測量

印刷的可食用薄膜（16平方厘米）在3 mL 1 M HCl中研磨直至完全崩解，過濾（0.45 mm Durapore PVDF Millipore），在21,000?g 20℃30 min，正己烷萃取。根據(jù)Garsuch和Breitkreutz(2010)以及Pan、Chen、Davidson和Zhong(2014)的方法，通過紫外分光光度法在273 nm處測量上清液中的Th。

Th的理論和實驗濃度使用以下公式計算：

理論計算

where

ThL ? Th Loaded in mg/cm3,

cd ? Th concentration in the dispersion of NQoThs, in mg,

dv ? drop volume in printing (resolution in dpi), in L/平方厘米,

PL ? number of printed layers on the film, and

t ? Film thickness, in cm.

實驗計算

where

ThL ? Th Loaded, in mg/cm3,

cf ? Th concentration in the film, in mg,

Pa ? Printed area, in 平方厘米, and

t ? Film thickness, in cm.

摻入效率(%)

where:

IE ? Th incorporation efficiency (%),

EL ? Experimental Load, and

TL ? Theoretical Load.

2.8.薄膜結(jié)構(gòu)特性

2.8.1.X射線衍射

X射線衍射是使用Siemens D-5000粉末X射線衍射儀和CuKa輻射（l 1.54埃；0.02度）進行的。選擇1.7-80度的θ范圍來分析晶體結(jié)構(gòu)。對Qo和Qo/EPQ印刷薄膜進行X射線分析。

2.8.2.薄膜微結(jié)構(gòu)

通過在Hitachi TM臺式顯微鏡（軟件TM3000）上的掃描電子顯微鏡（SEM）對所選薄膜的微觀結(jié)構(gòu)進行表征。在檢查之前，使用雙面膠帶將薄膜安裝在直徑為10毫米的圓柱形模具中，然后在氬氣氣氛(PELCO 91000)中以20 kV的電壓濺射鍍金3分鐘，以使其具有導(dǎo)電性。

2.8.3.薄膜的機械性能

拉伸機械性能在配備500 N稱重傳感器的萬能拉伸試驗機（LLOYD型號LR5K，英國）上測定。

拉伸強度(TS)和斷裂伸長率(%E)使用智利官方標準方法(NCh1151,1999)測定，該方法等效于ISO R1184-1970標準方法。薄膜樣品被切成10毫米？50毫米的條帶，并使用雙夾鉗以30毫米的間隔以20毫米/分鐘的測試速度進行測試。記錄曲線載荷與伸長的關(guān)系，直到達到斷裂伸長率。TS以MPa表示，并通過將最大載荷(N)除以橫截面積(m2)計算得出。最大斷裂伸長率或%E是通過將斷裂時的伸長率除以樣品的初始標距并乘以100來確定的。報告的TS和%E值是對每種類型的樣品進行的至少四次測量的平均值電影。

2.8.4.厚度

薄膜厚度（mm）是在薄膜樣品上確定的，并通過數(shù)字千分尺（Mitutoyo 293340）進行測量；每部電影平均得分為九分。

2.9.水蒸氣滲透率(WVP)

WVP測量是根據(jù)智利官方標準方法(NCh2098,2000)進行的，該方法等效于ASTM D1653-93和DIN 52615標準方法，使用濕杯法并測試每個樣品的六個薄膜。杯中裝滿蒸餾水至距頂部邊緣6毫米的高度。用硅膠將薄膜密封在杯子上。將杯子置于冷藏相機中，溫度為0±0.6℃，相對濕度為85±2%。稱量杯子的重量直至恒重。WVP是從方程估計的。(4)根據(jù)McHugh、Avena-Bustillos和Krochta(1993)。

其中WVP=水蒸氣滲透率，單位g mm m-2次方h-1次方Pa-1次方；ε=厚度mm；m=質(zhì)量隨時間的變化，單位為g；t=h中的時間；A=薄膜面積，m2；和DP=杯內(nèi)薄膜表面的校正水蒸汽分壓e柜內(nèi)薄膜外表面的水蒸汽分壓。

2.10.從印刷的可食用薄膜中釋放納米封裝的Th

使用Franz連續(xù)垂直擴散池(Gilson Inc.Middleton,WI 53562)測定Qo和Qo/EPQ薄膜中NQoThs的釋放。細胞的有效擴散面積為4.7平方厘米。將薄膜安裝在受體和供體隔室之間（印刷面朝下）。接受室充滿1.5mL蒸餾水并保持在20℃。每天從受體中取出1.5 mL樣品。將流量調(diào)整為3 mL/天，持續(xù)8天。使用紫外分光光度計（見2.5）在273 nm處測定樣品的Th。結(jié)果表示為每厘米3薄膜釋放的Th毫克數(shù)。

2.11.抗菌活性

2.11.1.接種物的制備

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣大腸桿菌和無害李斯特菌分別在10 mL胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中在搖床中以37毫升培養(yǎng)24小時。細菌的光密度(OD)在標準McFarland標度上調(diào)整為0.5。獲得的細胞最終濃度約為10-5次方—10-6次方CFU/mL。

2.11.2.NQo和NQoTh分散體的最小抑菌濃度(MIC)

評估了納米顆粒對腐敗細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣大腸桿菌和無害乳桿菌生長的AM。

從儲備分散體(4.4±0.1 mg/mL)制備NQoTh分散體的系列稀釋液，直到濃度降低到10%。MIC被記錄為在37℃（無濁度）Yoksan和Chirachanchai（2010）下孵育24小時后導(dǎo)致微生物無可見生長的最低濃度。

2.11.3.圓盤擴散法的抗菌活性

根據(jù)Bauer、Kirby、Sherris和Turck(1966)和NCCLS（國家臨床實驗室標準委員會，1990）。

將在20%甘油中印有NQoThs的兩層薄膜切成6 mm2的圓盤（以獲得3.0 mg/mm3 Th）并放置在接種有以下物質(zhì)的懸浮液（0.1 mL of 106 CFU/mL）的Müller-Hinton瓊脂平板表面上每個微生物。為了比較參數(shù)，使用未印刷的薄膜（對照）和在沒有Th的情況下制備的在20%甘油中含有NQos的印刷薄膜。37℃培養(yǎng)24h，通過測量無微生物生長區(qū)域的直徑來估計抑菌圈。

2.12.統(tǒng)計分析

每個實驗至少進行3次，每次分析一式三份進行。通過方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行分析，并使用Tukey的多極差檢驗（Statgraphic 4.0版）測量平均值之間的顯著差異。使用<0.05的p值來確定顯著性。

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