什么是去垢劑？

去垢劑是兩親性分子，包含極性或帶電親水基團(tuán)(頭部)和在長(zhǎng)親脂性烴基基團(tuán)（尾部）（圖1）。由于可降低水的表面張力，它們也被稱(chēng)為表面活性劑。

圖1.陰離子去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）的結(jié)構(gòu)，顯示出了疏水區(qū)域和親水區(qū)域。

這些結(jié)構(gòu)特性使得去垢劑可以在水性介質(zhì)中聚集。在足夠高的濃度下，每個(gè)分子的極性親水區(qū)域朝向極性溶質(zhì)（水），而疏水區(qū)域聚集在一起，形成一個(gè)具有疏水核心的熱力學(xué)穩(wěn)定的膠束。去垢劑膠束的疏水核心區(qū)域與蛋白質(zhì)的疏水表面結(jié)合，形成可溶性的蛋白質(zhì)-去垢劑復(fù)合物。圖2是膠束的一個(gè)簡(jiǎn)單圖例，用于演示朝向這一概念。實(shí)際的膠束結(jié)構(gòu)是更復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的，并可以根據(jù)去垢劑的濃度和溶液的組成而變化。1

圖2.十二烷基硫酸鈉膠束的簡(jiǎn)單圖例。

生物去垢劑通常用于破壞細(xì)胞的雙極脂質(zhì)膜，從而釋放和溶解膜結(jié)合蛋白。一些去垢劑可被用于溶解重組蛋白，而另一些則被用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、結(jié)晶和變性。去垢劑可以在水/非水界面處排列，從而降低表面張力，增加混溶性并穩(wěn)定乳狀液。其他的去垢劑應(yīng)用包括：

提取DNA和RNA

溶解標(biāo)本用于診斷應(yīng)用

細(xì)胞裂解

脂質(zhì)體制備

防止溶液中的試劑和被分析物沉淀

防止免疫測(cè)定中的非特異性結(jié)合

去垢劑的物理特性

膠束開(kāi)始形成時(shí)的濃度被稱(chēng)作臨界膠束濃度（CMC）。CMC是單體的最大濃度，并且可以因此對(duì)形成膠束的自由能進(jìn)行量度。CMC越低，膠束越穩(wěn)定，并且分子并入膠束或脫離膠束的速度越慢。去垢劑疏水區(qū)域的結(jié)構(gòu)會(huì)影響膠束的結(jié)構(gòu)。離子型去垢劑疏水烴鏈的長(zhǎng)度增加會(huì)導(dǎo)致膠束增大和CMC降低，同時(shí)構(gòu)建膠束需要的分子也減少。

膠束中單體的平均數(shù)量被稱(chēng)作聚集數(shù)。CMC和聚集數(shù)的值很大程度上取決于以下因素：溫度、pH、離子強(qiáng)度以及去垢劑的均一性和純度。用來(lái)測(cè)定CMC和聚集數(shù)的分析方法的不同可能會(huì)造成報(bào)道數(shù)值的輕微差異。聚集數(shù)的值也會(huì)因濃度而變化，當(dāng)濃度高于CMC時(shí)，單位膠束中的去垢劑分子數(shù)目會(huì)增加。

易于去除或交換是選擇去垢劑時(shí)需考慮的一個(gè)重要因素。一些常見(jiàn)的去除去垢劑的方法包括：

透析

凝膠過(guò)濾色譜

疏水吸附色譜

蛋白沉淀

去垢劑相關(guān)的CMC值是疏水結(jié)合強(qiáng)度的重要參考。去垢劑的CMC值越高其結(jié)合越弱，相應(yīng)的也越容易通過(guò)透析或置換方法去除。而CMC值較低的去垢劑則只需要較少的去垢劑就可以形成膠束并溶解蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。

另一個(gè)用于評(píng)估后續(xù)去除去垢劑難易度的有用參數(shù)是膠束分子量，表示相對(duì)膠束大小。越小的膠束越容易去除，在基于蛋白質(zhì)分子尺寸的蛋白質(zhì)-去垢劑復(fù)合物分離時(shí)效果也更理想。膠束分子量可以用單體分子量乘上聚集數(shù)來(lái)計(jì)算。

濁點(diǎn)是指當(dāng)濃度接近或高于CMC時(shí)，去垢劑溶液分離成兩相的溫度。膠束聚集，形成高去垢劑濃度的混濁相，而溶液達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí)會(huì)耗盡去垢劑。得到的兩相溶液可以被分離，提取出的蛋白質(zhì)位于富含去垢劑的相中。因?yàn)楦邼狳c(diǎn)溫度會(huì)造成溶解蛋白質(zhì)的變性，因此在蛋白質(zhì)存在時(shí)推薦使用低濁點(diǎn)的去垢劑，例如TRITONX-114（濁點(diǎn)~23°C）。去垢劑濃度和溫度的變化以及添加鹽或聚合物（例如葡聚糖和聚乙二醇）等因素都會(huì)影響濁點(diǎn)。需要注意的是富含去垢劑的相也取決于去垢劑的種類(lèi)和鹽濃度；在某些條件下，相可以是澄清的而不是混濁的，可以作為溶液的上相或下相。對(duì)于非離子型去垢劑，這一特點(diǎn)已被用于膜蛋白的相分離和提純。2

去垢劑的種類(lèi)和選擇

選擇去垢劑時(shí)，首先需要考慮的通常是親水基團(tuán)的組成：

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，去垢劑可大體分為：3

離子型

兩性離子型

非離子型

離子型去垢劑

離子型去污劑含有陰離子或陽(yáng)離子頭部基團(tuán)，并具有凈電荷。它們的疏水尾巴要么是直鏈烴鏈（例如十二烷基硫酸鈉（SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）），要么是剛性甾體基團(tuán)（例如膽汁酸鹽）4。離子去污劑膠束的大小取決于側(cè)鏈的疏水引力和離子基團(tuán)的斥力。因此，通過(guò)增加中和頭部基團(tuán)上電荷的抗衡離子濃度，可形成較大的膠束尺寸。膠束的大小也隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增加。離子去污劑在膜蛋白增溶方面非常有效，但難免或多或少造成變性5。

膽汁酸鹽是陰離子去垢劑，具有由剛性甾族基團(tuán)（例如膽酸和脫氧膽酸的鈉鹽）組成的主鏈。由于為平面結(jié)構(gòu)，這些分子具有極性和非極性的表面；因此，它們的CMC較高且其膠束較小，易于通過(guò)透析去除。6膽汁酸鹽是相對(duì)溫和的去垢劑，與同頭部基團(tuán)的線性鏈去垢劑相比，其失活性通常較小。7未偶聯(lián)的膽汁酸鹽單體pKa值約為5-6，在低pH值下溶解度有限。但是，在任何給定的pH值下，膽汁酸偶聯(lián)都會(huì)降低pKa，產(chǎn)生更大比例的離子化分子。由于離子鹽形式比質(zhì)子化酸形式更易溶于水，因此在低pH值下，偶聯(lián)可增加溶解度8。

非離子型去垢劑

非離子型洗滌劑含有不帶電荷的親水性頭基，由聚氧乙烯部分（如BRIJ和TRITON去垢劑）或糖苷基團(tuán)（如辛基葡糖苷和十二烷基麥芽糖苷）組成。由于非離子型去污劑會(huì)破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)和脂質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，但不會(huì)破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，因此被認(rèn)為是非變性。9因此，它們廣泛用于分離生物活性形式的膜蛋白。與離子型去垢劑不同，鹽對(duì)非離子型洗滌劑的膠束尺寸影響極小。5

具有聚氧乙烯頭基團(tuán)的去垢劑可以包含烷基聚乙烯醚(CnH2n+1(OCH2CH2)xOH)，或烷基鏈與醚基之間包含苯環(huán)。TRITONX-100去垢劑屬于后一類(lèi)。需要注意的是，含有芳香環(huán)的去垢劑在紫外線區(qū)域吸收。它們可能會(huì)干擾分光光度法280 nm處的蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)。這些去垢劑可提供氫化形式，其中芳香環(huán)被還原以消除紫外線吸收。但是，在這種還原制劑中可能存在少量未反應(yīng)的材料。在某些應(yīng)用中，具有脂族疏水部分的市售聚氧乙烯去垢劑可以代替某些芳族聚氧乙烯。例如，在紫外線不可見(jiàn)光波長(zhǎng)應(yīng)用中，通?？刹捎肨ERGITOL 15-S-9、TERGITOL TMN-10、聚氧乙烯10月桂基醚和聚氧乙烯10十三烷基醚代替TRITONX-100。這些去垢劑具有脂族疏水部分，因此不會(huì)明顯吸收紫外線區(qū)間波長(zhǎng)。

盡管聚氧乙烯比合成的非離子型去垢劑（如烷基糖苷）具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)，但由于兩大原因，后者在許多應(yīng)用中仍是首選去垢劑。首先，它們的組成和結(jié)構(gòu)均一。其次，可利用它們輕松合成幾種包含不同烴鏈和極性糖基組合的烷基糖苷變體。可利用附接到葡萄糖、麥芽糖或蔗糖頭基上，帶有各種烷基鏈的烷基糖苷的理化性質(zhì)細(xì)微差異，選擇性溶解膜蛋白。10

兩性去垢劑

兩性去垢劑同時(shí)具有離子型和非離子型去垢劑的特點(diǎn)。和非離子型去垢劑一樣，兩性去垢劑不具有凈電荷，無(wú)導(dǎo)電性和電泳遷移性，且不與離子交換樹(shù)脂結(jié)合。但和離子型去垢劑一樣，它們可以有效地破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。與線性鏈兩性離子去垢劑（例如十二烷基二甲基二胺氧化物）相比，固醇類(lèi)兩性去垢劑（例如CHAPS）的變性概率較小。7

非去垢劑磺基甜菜堿

非去垢劑磺基甜菜堿(NDSB)是兩性離子化合物。和去垢劑磺基甜菜堿（SB）–例如線性SB（例如SB 3-16、SB 3-10、3-12后文3-14）、11 CHAPS12和氨基磺基甜菜堿（例如N-烷基氨基丙基-N，N二甲基氨基烷基磺酸鹽）13一樣–NDSB帶有磺基甜菜堿親水性頭基。但與SBs相比，NDSB中的疏水基太短，即使?jié)舛雀哌_(dá)1 M時(shí)也無(wú)法形成膠束。因此，NDSB易于通過(guò)透析去除，且易于在色譜基質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中擴(kuò)散，適用于電泳應(yīng)用。

NDSB首先用于天然等電聚焦實(shí)驗(yàn)中，以在不增加電導(dǎo)率的情況下篩選靜電相互作用。14從那時(shí)起，它們被廣泛應(yīng)用，包括蛋白質(zhì)的增溶和結(jié)晶14,15，以及化學(xué)和生物變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和重折疊。16憑借短疏水基團(tuán)和電荷屏蔽作用，NDSB可防止聚集并提高膜蛋白產(chǎn)量。此外，NDSB不會(huì)干擾涉及硝基苯基的顯色底物的酶法測(cè)定，且不會(huì)抑制酶（例如β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶）的活性。14值得注意的是，NDSB-195、NDSB-211和NDSB-221不吸收280 nm波長(zhǎng)的光線；因此，它們與蛋白質(zhì)純化程序兼容，可在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中通過(guò)測(cè)量該波長(zhǎng)吸光度監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)濃度。17

去垢劑選擇指南

如果裂解液或勻漿100,000 x g離心1小時(shí)后上清液中存在膜蛋白，則認(rèn)為該膜蛋白已溶解。在大多數(shù)情況下，去垢劑溶解后，會(huì)在上清液中保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。因此，適當(dāng)?shù)娜ス竸?huì)在上清液中產(chǎn)生大量生物活性蛋白。鑒于當(dāng)今市面上的去垢劑種類(lèi)眾多，選擇合適的去垢劑可能會(huì)很困難。下面概述了部分有助于選擇合適的去垢劑的要點(diǎn)。

查閱文獻(xiàn)，嘗試使用先前已用于分離和表征類(lèi)似生化或酶學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的去垢劑。

考慮去垢劑在工作溫度下的溶解度。例如，丙磺酸二甲基棕櫚酰胺（SB3-16）在4°C下不溶于水，而TRITONX-114去垢劑在室溫下會(huì)發(fā)生相分離。

考慮去垢劑去除方法。如果要進(jìn)行透析，顯然優(yōu)選高CMC去垢劑。如果使用離子交換色譜，則非離子或兩性離子去垢劑更佳。

保留活性生物或酶活性可能需要試驗(yàn)幾種去垢劑。除去垢劑種類(lèi)外，去垢劑用量也會(huì)影響蛋白質(zhì)活性。對(duì)于某些蛋白質(zhì)，僅可在很窄的去垢劑濃度范圍內(nèi)保留其生物學(xué)活性。低于該范圍，蛋白質(zhì)不溶解；高于特定濃度，蛋白質(zhì)滅活。

考慮下游應(yīng)用。由于TRITONX-100去垢劑含有260-280 nm吸收波長(zhǎng)的芳環(huán)，因此如果操作規(guī)范要求紫外線監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)濃度，則應(yīng)避免使用這種去垢劑。同樣，如果要等電聚焦分離蛋白質(zhì)，則應(yīng)避免使用離子型去垢劑。進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾時(shí)，應(yīng)考慮使用聚集數(shù)較小的去垢劑。

考慮去垢劑純度。應(yīng)使用純度盡可能高的去垢劑，因?yàn)槟壳按_知某些去垢劑（例如TRITONX-100）含有過(guò)氧化物污染物。

對(duì)于存在DNase、RNase和蛋白酶等污染問(wèn)題的任何研究，可使用多種分子生物學(xué)級(jí)去垢劑。

與有毒去垢劑相比，優(yōu)先選擇無(wú)毒去垢劑。例如，洋地黃毒苷（洋地黃甙）需要特別小心處理。

由于未知的原因，某些去垢劑通常可以更好地用于特定分離程序。例如，目前已發(fā)現(xiàn)正十二烷基-β-D-麥芽糖苷是用于分離細(xì)胞色素C氧化酶的首選去垢劑。因此，可能需要通過(guò)一些“試錯(cuò)”方法，確定分離生物活性膜蛋白的最佳條件。

有時(shí)很難找到理想的去垢劑溶解和分析特定蛋白質(zhì)。在這種情況下，通常可以用一種去垢劑溶解蛋白質(zhì)，然后再用對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最小的另一種去垢劑代替。

在某些情況下，已觀察到隔離緩沖液中含有磺基甜菜堿（NDSB）去垢劑可大幅提高可溶性膜蛋白產(chǎn)量。