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LB膜分析儀-α-短螺旋抗菌肽對(duì)癌細(xì)胞選擇性及其抗癌作用的分子機(jī)制:結(jié)果、討論、結(jié)論、致謝!
來(lái)源:上海謂載 瀏覽 1744 次 發(fā)布時(shí)間:2022-02-28
3.結(jié)果
3.1.體外抗癌能力和選擇性
G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)肽是通過(guò)Fmoc固相肽合成協(xié)議[9e11]合成的。CD研究表明,這些肽主要存在于緩沖溶液中的無(wú)序結(jié)構(gòu)中。在添加到DPPG(二棕櫚酰磷脂酰甘油)SUV(模擬帶負(fù)電荷的細(xì)菌和癌細(xì)胞膜的小單層囊泡)中后,除了GIIKKI-NH2外,肽采用a-螺旋構(gòu)象。兩親螺旋結(jié)構(gòu)有利于它們與脂質(zhì)雙層的相互作用,但GIIKKI-NH2始終保持未折疊狀態(tài),無(wú)論周圍環(huán)境發(fā)生任何變化。二級(jí)結(jié)構(gòu)的這種缺乏變化與其缺乏生物活性很好地一致。隨后的細(xì)胞研究集中于n?2、3和4的系列。
按照濃度依賴性模式,重復(fù)次數(shù)較多或長(zhǎng)度較長(zhǎng)的肽在殺死癌細(xì)胞(HeLa和HL60細(xì)胞)方面更有效,但對(duì)正常細(xì)胞(紅細(xì)胞和HDFa細(xì)胞)的體外毒性也開始增加,如圖1aec所示??偟膩?lái)說(shuō),就體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性而言,G(IIKK)3I-NH2是最佳序列,其對(duì)HeLa和HL60細(xì)胞的IC50值為15和25 mM,EC50遠(yuǎn)大于250 mM(IC50:濃度導(dǎo)致50%的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制;EC50:濃度誘導(dǎo)50%的紅細(xì)胞溶解)。重要的是,HDFa細(xì)胞對(duì)這些肽有良好的耐受性,例如,在濃度低于50 mM時(shí),G(IIKK)3I-NH2對(duì)HDFa細(xì)胞的影響微不足道(圖1c)。我們合理設(shè)計(jì)的短肽的這種性能明顯優(yōu)于天然AMP,如馬蓋寧和蜂毒素,并且在有效性、選擇性甚至耐藥性方面也優(yōu)于抗癌藥物順鉑[12e15]。例如,在類似的實(shí)驗(yàn)條件下,magainin-2對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50低于60 mM,而蜂毒肽在5 mM下的EC50則低得多,顯示出對(duì)宿主細(xì)胞的高毒性[12e14]。
圖1。設(shè)計(jì)的a-螺旋肽的細(xì)胞毒性和選擇性。(a)對(duì)HeLa和HL60細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(b)人類紅細(xì)胞溶血。(c)對(duì)HDFa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(d)FITC-G(IIKK)3I-NH2在含有HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分布。
然后,我們進(jìn)一步評(píng)估了基于體外共培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞選擇性,該系統(tǒng)包含HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞,它們與體內(nèi)環(huán)境非常相似[8]。將最終濃度為20 mM的FITC-G(IIKK)3I-NH2添加到系統(tǒng)中,培養(yǎng)1 h后,用熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞中的肽分布(圖1d)。很明顯,綠色熒光集中在懸浮和圓形HL60細(xì)胞中,而不是粘附和紡錘形HDFa細(xì)胞中,這再次表明肽具有良好的細(xì)胞選擇性,以及對(duì)癌細(xì)胞的快速識(shí)別。
3.2.肽與脂質(zhì)單層的選擇性相互作用
在這個(gè)階段,這些肽的選擇性背后的機(jī)制過(guò)程在很大程度上仍不清楚,但抗癌肽主要是膜活性的,它們對(duì)癌細(xì)胞的作用方式涉及膜破壞。此外,它們對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷與癌細(xì)胞的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞膜特征密切相關(guān),即凈負(fù)表面電荷和更大的膜流動(dòng)性[2,3,16]。為了了解肽和細(xì)胞膜之間的特殊相互作用以及分子水平上抗癌作用的基本過(guò)程,我們轉(zhuǎn)向使用脂質(zhì)單層的膜模型。圖2a顯示了在最終濃度為3 mM的條件下,將G(IIKK)(2e4)I-NH2注入亞相時(shí),DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)和DPPG單層(分別模擬正常哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和癌細(xì)胞外膜)的表面壓力從不同的初始表面壓力(pi)增加(Dp),同時(shí)保持表面積不變。所有的肽都表現(xiàn)出對(duì)帶負(fù)電荷的DPPG單層的明顯偏好,而對(duì)兩性離子DPPC單層的親和力則要小得多。在Dp?0處對(duì)每個(gè)壓力圖進(jìn)行外推,得出排除壓力,超過(guò)該壓力,肽不再能夠穿透脂質(zhì)單層,從而導(dǎo)致表面壓力進(jìn)一步增加。對(duì)于兩性離子DPPC單層,G(IIKK)2I-NH2的排斥壓力為23.4 mN/m,遠(yuǎn)低于生物膜的30e35 mN/m生理范圍[17,18],這與其對(duì)紅細(xì)胞的毒性很小相符。相比之下,G(IIKK)(3e4)I-NH2的值分別增加到32.0和37.6 mN/m,這與它們的溶血活性增加一致。另一方面,對(duì)于帶負(fù)電荷的DPPG單層,排斥壓力分別顯著增加至37.3、40.6和42.6 mN/m,表明陽(yáng)離子肽電荷和陰離子脂質(zhì)頭基團(tuán)之間的靜電相互作用起著關(guān)鍵作用。盡管DPPC和DPPG單分子膜對(duì)G(IIKK)2I-NH2的排斥壓差較大(參見補(bǔ)充數(shù)據(jù),圖S1),但其對(duì)后者的排斥壓僅略高于生物膜30e 35 mN/m的生理范圍,這與其殺死癌細(xì)胞的效率較低一致,因此,這種肽在癌癥治療中沒有吸引力。另一方面,G(IIKK)4I-NH2對(duì)兩性離子DPPC單分子膜的排斥壓力為37.6 mN/m,略高于30e35 mN/m的生理范圍,這與該系列中表現(xiàn)出的最高溶血能力一致。G(IIKK)3I-NH2顯示出中間值,DPPC單層的Dp值為32.0 mN/m,DPPG單層的Dp值為40.6 mN/m,這與體外細(xì)胞工作中的最佳細(xì)胞選擇性一致。
圖2。肽與不同脂質(zhì)單層的相互作用。(a)當(dāng)肽以3 mM濃度注入亞相時(shí),在不同初始表面壓力(pi)下,DPPC和DPPG單分子膜的表面壓力增加(Dp)。(b)將G(IIKK)3I-NH2注入DPPC和POPC單分子膜的亞相后的表面壓力與時(shí)間的關(guān)系。
癌細(xì)胞中膽固醇水平的降低和具有不飽和脂肪酰鏈的脂質(zhì)的增加可能是膜流動(dòng)性增加的原因[19]。將最終濃度為3 mM的G(IIKK)3I-NH2注入亞相后,飽和DPPC和不飽和棕櫚酰油酰磷酰膽堿(POPC)單分子膜的平衡表面壓力增加趨于3.5和10 mN/m,初始表面壓力為30 mN/m(圖2b),表明無(wú)論膜電荷相互作用如何,增加的膜流動(dòng)性確實(shí)有利于表面活性肽的膜滲透。
3.3.肽的原位定位和質(zhì)膜完整性
為了在與HeLa細(xì)胞孵育期間精確定位抗癌肽,使用濃度為10 mM的FITC-G(IIKK)3I-NH2,并使用激光共聚焦顯微鏡觀察其在這些細(xì)胞中的熒光分布,與孵育時(shí)間有關(guān)。孵育1小時(shí)后,大部分FITC衍生信號(hào)(綠色(網(wǎng)絡(luò)版))位于HeLa細(xì)胞膜上,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到相對(duì)較弱的熒光信號(hào)(圖3a),表明細(xì)胞周圍的膜是這一時(shí)期的主要靶點(diǎn)。然而,孵育24小時(shí)后,熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)積累(圖3b),表明肽穿過(guò)外脂雙層的易位。此外,處理24小時(shí)后,細(xì)胞邊界變得明顯模糊,這可能是因?yàn)樵诖诉^(guò)程中細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)逐漸退化。因此,人們很好地預(yù)期,在易位后,肽會(huì)與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)(如線粒體)相互作用,觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
圖3。肽的原位定位和質(zhì)膜完整性。(a)用10mM FITC-G(IIKK)3I-NH2孵育1h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。(b)用10mM FITC-G(IIKK)3I-NH2孵育24h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。(c)未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。(d)用10mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。
為了確定與肽結(jié)合后的膜通透性,我們進(jìn)行了鈣黃綠素AM釋放試驗(yàn)。與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育10 min導(dǎo)致約20%的鈣黃綠酸從HeLa細(xì)胞中釋放,表明其對(duì)癌細(xì)胞膜的快速滲透作用(參見補(bǔ)充數(shù)據(jù),圖S2)。正如預(yù)期的那樣,增加培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致更多的膜通透性,在培養(yǎng)6小時(shí)后,鈣黃綠素AM的釋放超過(guò)40%。在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),明顯的膜通透性與上述觀察到的肽與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合非常一致。
為了直接觀察G(IIKK)3I-NH2對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響,特別是在大多數(shù)肽分子轉(zhuǎn)移到膜上的較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后,我們進(jìn)行了SEM檢查。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示出正常的光滑表面,相鄰細(xì)胞之間具有良好的細(xì)胞間接觸(圖3c)。相比之下,用10 mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的改變(圖3d)。觀察到收縮的細(xì)胞膜明顯破裂和溶解。除了細(xì)胞膜損傷外,一些處理過(guò)的細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的表面起泡(圖3d的右圖),這是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的特征性事件[20]。
3.4.細(xì)胞凋亡
由于肽易位到細(xì)胞質(zhì)中,并且治療后的癌細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)學(xué),我們隨后遵循了細(xì)胞凋亡的幾個(gè)關(guān)鍵生化和形態(tài)學(xué)特征,旨在將凋亡誘導(dǎo)與HeLa細(xì)胞死亡聯(lián)系起來(lái),并揭示可能的凋亡途徑。
3.4.1.核形態(tài)變化與DNA斷裂
染色質(zhì)凝聚與DNA片段化平行是用于識(shí)別細(xì)胞凋亡的可靠標(biāo)準(zhǔn)[21]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色,我們首先比較了在37C溫度下用10 mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核變化(圖4a)。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且完整,彌漫性DAPI染色。相反,隨著熒光強(qiáng)度的增加,肽處理的細(xì)胞核形狀發(fā)生改變,染色質(zhì)聚集成不規(guī)則的致密團(tuán)塊。此外,在不同的培養(yǎng)時(shí)間從處理過(guò)的HeLa細(xì)胞中提取基因組DNA,然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。孵育12小時(shí)后,出現(xiàn)寡核苷酸大小的DNA片段,并且隨著孵育時(shí)間的增加,模式變得更加明顯(圖4b)。相比之下,從未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞中分離的DNA條帶是單一的,沒有發(fā)生DNA斷裂。有人提出,一旦染色質(zhì)完整性受損,一些激活酶(如內(nèi)源性核酸酶)負(fù)責(zé)將染色質(zhì)DNA切割成180e200 bp的片段及其整數(shù)倍[22e 24]。
圖4。細(xì)胞凋亡的生化和形態(tài)學(xué)特征。(a)HeLa細(xì)胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時(shí)前后的DAPI核染色。(b)HeLa細(xì)胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育后提取的基因組DNA的凝膠電泳分析。(c)在與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時(shí)之前和之后,用FITC phalloidin對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行F-肌動(dòng)蛋白染色。
3.4.2.細(xì)胞骨架改變
肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)內(nèi)部和外部信號(hào)的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[25]。它有一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),具有獨(dú)特的形式,適用于運(yùn)動(dòng)、粘附、分裂和細(xì)胞死亡等特定任務(wù)[26e28]。異常F-肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的發(fā)展密切相關(guān),通常伴隨著ROS的線粒體釋放[28]。在與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育之前和之后,用FITC phalloidin對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色,以顯示F-肌動(dòng)蛋白(絲狀肌動(dòng)蛋白)。對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞,纖細(xì)的微絲束平行于細(xì)胞的長(zhǎng)軸,而F-肌動(dòng)蛋白隨著處理的細(xì)胞變得紊亂和縮短(圖4c)。
3.4.3.線粒體途徑
線粒體在細(xì)胞凋亡中起著核心作用,凋亡死亡中的許多關(guān)鍵因素和事件都受其調(diào)控。一些凋亡蛋白可以靶向線粒體,通過(guò)形成膜孔或增加線粒體膜通透性導(dǎo)致線粒體腫脹。這兩個(gè)過(guò)程都允許釋放凋亡效應(yīng)器[29e32]。在這項(xiàng)工作中,成功地觀察到線粒體途徑與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們首先以JC-1為探針,觀察線粒體膜電位的變化[33]。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示線粒體橙紅色熒光和少量綠色熒光(網(wǎng)絡(luò)版)。與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時(shí)后,綠色熒光占主導(dǎo)地位(圖5a),表明線粒體膜電位顯著喪失。線粒體膜電位的這種去極化通常伴隨著線粒體膜通透性的增加和Cyt c的釋放[34]。然后,我們進(jìn)行了免疫熒光成像,該成像顯示未經(jīng)處理的細(xì)胞中Cyt c的清晰、顆粒狀染色模式,與G(IIKK)3I-NH2處理的細(xì)胞中Cyt c的更彌散染色形成對(duì)比(圖5b)。這種差異表明細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中,與觀察到的線粒體膜電位去極化高度一致。在細(xì)胞質(zhì)中,釋放的Cyt-c可以在dATP存在下誘導(dǎo)Apaf-1和caspase-9之間的相互作用,從而進(jìn)一步激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡[35]。
圖5.圖5。線粒體功能障礙與Fas-FasL通路。(a)用10mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的JC-1線粒體膜電位染色的熒光圖像。(b)用10mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的Cyt c免疫熒光染色。(c)Caspase-8,與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育后HeLa細(xì)胞的fas-L和fas基因轉(zhuǎn)錄。
3.4.4.死亡受體途徑
線粒體調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡可通過(guò)其他受體相關(guān)途徑放大,如Fas與其配體(Fas-L)的相互作用[36]。為了研究該肽是否啟動(dòng)了死亡受體途徑,我們進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR分析,以分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄(caspase-8、fas和fas-L)。10mM G(IIKK)3I-NH2處理的HeLa細(xì)胞在3至6h內(nèi)的caspase-8轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,而在孵育12h后急劇下降至正常值。fas和fas-L的轉(zhuǎn)錄遵循相同的趨勢(shì)(圖5c)。兩個(gè)基因(fas和fas-L)的高表達(dá)增加了它們相互作用的機(jī)會(huì)。這兩種分子的結(jié)合誘導(dǎo)了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)的形成,其中含有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10[36,37]。Fas圓盤啟動(dòng)了一個(gè)反饋回路,螺旋上升,增加了線粒體促凋亡因子的釋放和caspase-8的放大激活[38]。另一方面,半胱天冬酶-8誘導(dǎo)的凋亡也可以通過(guò)刺激線粒體釋放Cyt c來(lái)放大[39]。在G(IIKK)3INH2處理的HeLa細(xì)胞中,死亡受體通路基因的高轉(zhuǎn)錄意味著該肽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也參與了死亡受體依賴的方式。
3.5.免疫效應(yīng)
從活生物體中分離的天然抗菌肽在臨床上的應(yīng)用非常有限,因?yàn)樗鼈兊纳a(chǎn)成本高、溶血性高以及可能的免疫效應(yīng)[16]。除了通過(guò)高細(xì)胞選擇性降低生產(chǎn)成本和溶血作用外,所設(shè)計(jì)的螺旋肽的非免疫效應(yīng)對(duì)于開發(fā)其潛在應(yīng)用也至關(guān)重要。兩個(gè)細(xì)胞因子基因IL2和IL8被認(rèn)為是主要的免疫系統(tǒng)信號(hào)分子,它們能夠?qū)ξ⑸锔腥咀龀龇磻?yīng),并將外來(lái)分子(非自身)與人體自身細(xì)胞和分子(自身)區(qū)分開來(lái)[40,41]。因此,這兩個(gè)基因的高表達(dá)通常會(huì)誘發(fā)急性和慢性炎癥。因此,在用肽G(IIKK)3I-NH2處理人類淋巴細(xì)胞后,使用RT-PCR分析其細(xì)胞因子基因IL2和IL8的轉(zhuǎn)錄水平。如圖S3所示,肽培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞的IL2和IL8的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平低于或幾乎等于相應(yīng)對(duì)照組的水平,表明G(IIKK)3I-NH2與淋巴細(xì)胞的相互作用不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)。
3.6.體內(nèi)抗腫瘤性能
將人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于裸鼠皮下。腫瘤植入5天后,分別以1.5 mg/kg和5 mg/kg的劑量腹腔注射肽G(IIKK)3INH2和G(IIKK)4I-NH2。在給藥期間,未觀察到任何毒性跡象,如體重減輕和外觀不良(圖6b),盡管G(IIKK)4I-NH2顯示出更高的體外溶血性。與PBS中的陰性對(duì)照相比,這兩種肽對(duì)腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其中G(IIKK)4I-NH2表現(xiàn)出比G(IIKK)3I-NH2更好的療效(圖6c),這與它們的體外抗腫瘤趨勢(shì)一致。18天后,解剖腫瘤并稱重(圖6a和d)。在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下,G(IIKK)3I-NH2治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為0.23和0.31。G(IIKK)4I-NH2能產(chǎn)生更有效的抑制作用,在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下,抑制率分別為0.32和0.41。這些數(shù)據(jù)表明,在小鼠異種移植模型中,螺旋肽可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng),而腫瘤細(xì)胞不能被完全清除。許多抗腫瘤藥物的不完全抑制作用已被廣泛觀察到,這可歸因于多種機(jī)制,例如藥物從腫瘤部位相對(duì)較快地清除,以及它們難以通過(guò)壞死區(qū)域擴(kuò)散[42],但目前這組肽背后的確切原因有待進(jìn)一步的機(jī)理研究。
圖6。人宮頸癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)抗腫瘤作用。(a)給藥后解剖腫瘤。(b)給藥期間體重變化。(c)給藥期間腫瘤體積的變化。(d)給藥后的腫瘤抑制率。
4.討論
這些設(shè)計(jì)的肽短而規(guī)則。與典型的天然AMPs和流行的抗癌藥物順鉑相比,它們?cè)谝种瓢┘?xì)胞生長(zhǎng)方面的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、效力高、副作用小,使它們成為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的理想模型和靶點(diǎn)。這些肽在界面性質(zhì)和生物活性方面表現(xiàn)出系統(tǒng)性的變化。我們面臨的直接挑戰(zhàn)是如何將分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、界面性質(zhì)和破壞細(xì)胞膜的選擇性聯(lián)系起來(lái)。這代表了功能性生物材料研究的核心努力,從而在未來(lái)肽抗生素的合理設(shè)計(jì)和對(duì)其抗腫瘤性能的理解中獲得更好的分子洞察力。
我們之前在共培養(yǎng)環(huán)境下使用NIH 3T3細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞的研究表明,這些肽對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的作用模式大致相似,并解釋了為什么它們不會(huì)對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞造成傷害[8]。由于磷脂酰絲氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液化神經(jīng)節(jié)苷脂和硫酸肝素的表達(dá)升高,腫瘤細(xì)胞膜也攜帶凈負(fù)電荷。這種外膜表面的負(fù)電荷特征與細(xì)菌非常相似。這些肽和靶膜之間的靜電相互作用對(duì)選擇性反應(yīng)至關(guān)重要。
在所研究的短肽系列中,G(IIKK)3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長(zhǎng),與之前報(bào)道的抗菌活性和選擇性觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明,對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同區(qū)別反應(yīng)源自肽通過(guò)靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡對(duì)不同細(xì)胞膜的選擇性反應(yīng)。具體而言,負(fù)表面電荷和高度不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的對(duì)癌細(xì)胞的高親和力導(dǎo)致G(IIKK)3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合,并隨后導(dǎo)致膜通透性。肽分子隨后通過(guò)脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)移,并積聚在癌細(xì)胞內(nèi)部。這一過(guò)程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征,表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外,這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過(guò)程有關(guān):線粒體途徑和死亡受體途徑。
這些肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng),重要的是,它們?cè)诼闶篌w內(nèi)對(duì)異種移植物顯示出相當(dāng)大的生長(zhǎng)抑制作用,對(duì)宿主毒性很小,因此表明它們?cè)谂R床開發(fā)中具有巨大潛力。這些數(shù)據(jù)共同構(gòu)成了設(shè)計(jì)具有優(yōu)異生物相容性和選擇性的短肽生物材料的新范例的基礎(chǔ)。迄今為止,許多AMP通過(guò)從天然蛋白質(zhì)和肽中提取氨基酸序列來(lái)強(qiáng)調(diào)仿生作用。相比之下,在目前的工作中,我們采用了IIKK序列模塊基本單元的最小模擬,然后采用人工重復(fù)(n)和選擇性終端阻斷,從而大大提高了性能。未來(lái)的工作可以評(píng)估仿生學(xué)如何與合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相協(xié)調(diào)。目前尚不清楚一級(jí)序列的變化,例如用L、V和A替換I,或用R替換K,以及任何帶有短側(cè)鏈的非天然陽(yáng)離子氨基酸,將如何改變效力和選擇性。
另一方面,雖然短肽對(duì)不同細(xì)胞類型的選擇性反應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果,但細(xì)胞外膜表面精細(xì)而復(fù)雜。目前基于選擇性靜電相互作用的解釋充其量只能是一種簡(jiǎn)化的合理化。需要進(jìn)一步研究,通過(guò)不同層次的模型界面表示來(lái)揭示詳細(xì)的分子過(guò)程,從而更直接地了解不同細(xì)胞和亞細(xì)胞界面上的不同相互作用。因此,目前的工作為探索新的科學(xué)理解開辟了一系列具有挑戰(zhàn)性但令人興奮的實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)。結(jié)合短設(shè)計(jì)功能肽開發(fā)相關(guān)的模型生物界面將促進(jìn)新的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?,包括各種表面和界面成像、反射和散射,使用激光、x射線和中子束源。這些實(shí)驗(yàn)不僅將增加對(duì)生物界面過(guò)程的新理解,還將催生新技術(shù)。最后,之前的研究表明,表面活性劑樣短肽(如A9K)在抑制癌癥生長(zhǎng)方面也表現(xiàn)出很高的效力和選擇性[11],但這些肽促進(jìn)了水和膜樣環(huán)境下的b-折疊構(gòu)象,而不是本研究中報(bào)道的a-螺旋構(gòu)象。目前還不清楚如何不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致等效的高效力和選擇性,但具有明確的分子結(jié)構(gòu)奠定了一個(gè)有用的基礎(chǔ),為我們探討這些重要的差異,在未來(lái)的研究。對(duì)于從事跨學(xué)科研究的物理學(xué)家和材料研究人員來(lái)說(shuō),這些合理設(shè)計(jì)的模型比已經(jīng)報(bào)道的各種天然AMP和同系物更易于處理。無(wú)論爭(zhēng)論的方向和結(jié)果如何,這些短肽都將引起廣泛的興趣來(lái)探索其功能用途。效力的變化有不同的含義。例如,很短的肽可以用于皮膚護(hù)理,而較長(zhǎng)的、效力更大的肽可以用于治療開發(fā)。
5.結(jié)論
在一系列短肽G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)中,G(IIKK)3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長(zhǎng),與之前在抗菌活性和選擇性方面的觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明,對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同鑒別反應(yīng)源于肽通過(guò)靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡而產(chǎn)生的選擇性反應(yīng)。具體而言,負(fù)表面電荷和高不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的高親和力導(dǎo)致G(IIKK)3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合和隨后的膜通透性。然后,肽分子通過(guò)脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)運(yùn),并在癌細(xì)胞內(nèi)部積聚。這一過(guò)程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征,表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外,這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過(guò)程有關(guān):線粒體途徑和死亡受體途徑。最后,該肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng),重要的是,這些設(shè)計(jì)的肽在異種移植模型中顯示出相當(dāng)大的體內(nèi)抗腫瘤作用,而毒性很小,這兩者都表明它們作為功能材料在生物技術(shù)和臨床應(yīng)用中的潛力。
致謝
這項(xiàng)工作得到了中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金資助31271497,30900765號(hào)和21033005號(hào),山東省自然科學(xué)基金(ZR2009 9DQ00 1和JQ201105)和中央大學(xué)基礎(chǔ)研究基金(12CX04052A)的資助。我們還感謝英國(guó)工程和物理科學(xué)研究委員會(huì)(EPSRC)的支持。我們感謝英國(guó)皇家學(xué)會(huì)(倫敦)為HX提供中英獎(jiǎng)學(xué)金。