3、結果和討論

在表征脂肪酶對某些天然脂質的底物特異性時，最常用的方法是基于乳化反應體系，使用pH-stat法。雖然通過這種方法，我們可以得到酶對某些天然脂質底物的酶活性，并且可以滿足酶對界面的需求，但反應對底物和酶的需求是豐富的，當?shù)孜锘蛎竷r格昂貴或不易獲得時，不適合評估酶的活性。這種方法的另一個限制是，對于乳化體系，不可能控制“界面質量”，也不可能在恒定表面壓力下跟蹤脂肪酶的動力學行為[10]。據(jù)報道，表面壓力可以通過橫向密度的變化以及脂質組織和結構的變化影響脂質結構域的形成，最終影響脂肪酶的立體選擇性、區(qū)域選擇性和底物選擇性[17-19]。因此，傳統(tǒng)的pH-stat法對活性檢測仍有一定的局限性。此外，由于不同天然磷脂標準品的價格非常昂貴，因此沒有采用常規(guī)的活性測試方法。在此，使用小體積的酶和底物進行單層技術，并在反應過程中精確控制表面壓力，選擇單層技術來研究底物特異性。

圖1顯示了空氣-水界面上不同磷脂單層的π-A曲線形狀。這里測試的所有磷脂的π-A曲線的形狀都是在所有顯示的表面壓力下單一液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）狀態(tài)的特征。在壓縮時，單層經(jīng)歷了一個轉變，這被視為從LE（低于10 mN/m）到LC狀態(tài)的轉變。在高分子區(qū)域，由于分子堆積的增加，表面壓力升高，但不改變單層膜的彈性。最后，單分子膜達到了一種更為濃縮的狀態(tài)，但在π-a等溫線的形狀中沒有明顯的崩塌點。對于這里測試的磷脂，它們都可以形成穩(wěn)定的膜，并表現(xiàn)出良好的壓縮性能，DOPC的表面壓力甚至達到57 mN/m。

在本研究中，為了獲得商業(yè)酶對各種天然磷脂的底物選擇性信息，并為實際應用提供經(jīng)濟指導，商業(yè)酶直接使用，無需進一步加工。此外，子階段使用的緩沖液pH值調整為5.0，與油脫膠工業(yè)中使用的實際反應條件一致?；谏鲜靓?A曲線，我們最終選擇在10 mN/m到30 mN/m的表面壓差下測試超乳糖酸酶對不同磷脂的活性。

圖2示出了使用各種磷脂作為水解底物獲得的詳細活性-表面壓力曲線。可以看出，酶的水解活性高度依賴于表面壓力。然而，每種底物的活性曲線不同。發(fā)現(xiàn)基板PE、PS和CL的鐘形曲線具有特征性的最佳表面壓力值（圖2B、D、E）。在低于15 mN/m的表面壓力下，未檢測到基本酶活性。水解活性隨表面壓力的增加而增加。在25 mN/m的表面壓力下，觀察到PE、PS和CL的最大活性。然而，當表面壓力高于25 mN/m時，所有這些磷脂的水解活性降低。與所有測試的底物相比，在25 mN/m的表面壓力下，PE的水解率最高，水解活性達到5272.31×10-11摩爾。cm-2。最小-1。mL-1。對于PI，在15 mN/m以下也沒有觀察到水解速率，但是，沒有觀察到鐘形曲線，并且隨著表面壓力從15 mN/m增加到30 mN/m，活性增強（圖2C）。對于PC，從10 mN/m到25 mN/m觀察到鐘形曲線，但在30 mN/m的表面壓力下，活性進一步增加。隨著表面壓力從25 mN/m增加到30 mN/m，表面輪廓上的單層構象可能發(fā)生了變化，導致活性增加。在本實驗中，在測試的表面壓力范圍內，SM沒有活性。從π-A曲線可以看出，在25 mN/m的表面壓力下測試的所有磷脂都處于液態(tài)冷凝狀態(tài)，沒有達到各自的坍塌壓力。在這種情況下，超卵磷脂酶對不同單分子磷脂膜的偏好順序為PE>CL>PS>PI>PC。在這些條件下，SM沒有活性。Lecitase Ultra選擇性的詳細機制仍需闡明。

4、結論

利用單層技術，成功地表征了超乳糖酸酶對各種天然磷脂的底物特異性。在本研究中，除SM外，Lecitase Ultra對各種磷脂表現(xiàn)出廣泛的選擇性。在所有測試的磷脂中，觀察到對兩性磷脂PE的高度偏好。目前對Lecitase Ultra的研究為其底物選擇性提供了第一手信息，并為在原油脫膠或磷脂轉化過程中有效利用該酶提供了有利信息。

這項工作是由中國國家自然科學基金（31471690,31401627）、中國廣東省科技計劃（2013B0510000 09）和中國廣州珀爾里弗科技計劃（201610010074）提供的。作者聲明沒有利益沖突。

人物傳說

圖1不同磷脂的表面壓力-面積等溫線。

圖2使用不同磷脂的卵磷脂酶超水解活性隨表面壓力的變化。在室溫下，在零級槽中進行分析。緩沖液：50毫米檸檬酸緩沖液（pH值5.0）。活性表示為單位時間、單位反應室面積和“零級”槽中每毫升酶水解的底物摩爾數(shù)（摩爾數(shù)cm-2.min-1.mL-1）。