3、結(jié)果和討論

在表征脂肪酶對某些天然脂質(zhì)的底物特異性時，最常用的方法是基于乳化反應(yīng)體系，使用pH-stat法。雖然通過這種方法，我們可以得到酶對某些天然脂質(zhì)底物的酶活性，并且可以滿足酶對界面的需求，但反應(yīng)對底物和酶的需求是豐富的，當(dāng)?shù)孜锘蛎竷r格昂貴或不易獲得時，不適合評估酶的活性。這種方法的另一個限制是，對于乳化體系，不可能控制“界面質(zhì)量”，也不可能在恒定表面壓力下跟蹤脂肪酶的動力學(xué)行為[10]。據(jù)報道，表面壓力可以通過橫向密度的變化以及脂質(zhì)組織和結(jié)構(gòu)的變化影響脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成，最終影響脂肪酶的立體選擇性、區(qū)域選擇性和底物選擇性[17-19]。因此，傳統(tǒng)的pH-stat法對活性檢測仍有一定的局限性。此外，由于不同天然磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的價格非常昂貴，因此沒有采用常規(guī)的活性測試方法。在此，使用小體積的酶和底物進行單層技術(shù)，并在反應(yīng)過程中精確控制表面壓力，選擇單層技術(shù)來研究底物特異性。

圖1顯示了空氣-水界面上不同磷脂單層的π-A曲線形狀。這里測試的所有磷脂的π-A曲線的形狀都是在所有顯示的表面壓力下單一液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）狀態(tài)的特征。在壓縮時，單層經(jīng)歷了一個轉(zhuǎn)變，這被視為從LE（低于10 mN/m）到LC狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。在高分子區(qū)域，由于分子堆積的增加，表面壓力升高，但不改變單層膜的彈性。最后，單分子膜達(dá)到了一種更為濃縮的狀態(tài)，但在π-a等溫線的形狀中沒有明顯的崩塌點。對于這里測試的磷脂，它們都可以形成穩(wěn)定的膜，并表現(xiàn)出良好的壓縮性能，DOPC的表面壓力甚至達(dá)到57 mN/m。

在本研究中，為了獲得商業(yè)酶對各種天然磷脂的底物選擇性信息，并為實際應(yīng)用提供經(jīng)濟指導(dǎo)，商業(yè)酶直接使用，無需進一步加工。此外，子階段使用的緩沖液pH值調(diào)整為5.0，與油脫膠工業(yè)中使用的實際反應(yīng)條件一致。基于上述π-A曲線，我們最終選擇在10 mN/m到30 mN/m的表面壓差下測試超乳糖酸酶對不同磷脂的活性。

圖2示出了使用各種磷脂作為水解底物獲得的詳細(xì)活性-表面壓力曲線?？梢钥闯觯傅乃饣钚愿叨纫蕾囉诒砻鎵毫?。然而，每種底物的活性曲線不同。發(fā)現(xiàn)基板PE、PS和CL的鐘形曲線具有特征性的最佳表面壓力值（圖2B、D、E）。在低于15 mN/m的表面壓力下，未檢測到基本酶活性。水解活性隨表面壓力的增加而增加。在25 mN/m的表面壓力下，觀察到PE、PS和CL的最大活性。然而，當(dāng)表面壓力高于25 mN/m時，所有這些磷脂的水解活性降低。與所有測試的底物相比，在25 mN/m的表面壓力下，PE的水解率最高，水解活性達(dá)到5272.31×10-11摩爾。cm-2。最小-1。mL-1。對于PI，在15 mN/m以下也沒有觀察到水解速率，但是，沒有觀察到鐘形曲線，并且隨著表面壓力從15 mN/m增加到30 mN/m，活性增強（圖2C）。對于PC，從10 mN/m到25 mN/m觀察到鐘形曲線，但在30 mN/m的表面壓力下，活性進一步增加。隨著表面壓力從25 mN/m增加到30 mN/m，表面輪廓上的單層構(gòu)象可能發(fā)生了變化，導(dǎo)致活性增加。在本實驗中，在測試的表面壓力范圍內(nèi)，SM沒有活性。從π-A曲線可以看出，在25 mN/m的表面壓力下測試的所有磷脂都處于液態(tài)冷凝狀態(tài)，沒有達(dá)到各自的坍塌壓力。在這種情況下，超卵磷脂酶對不同單分子磷脂膜的偏好順序為PE>CL>PS>PI>PC。在這些條件下，SM沒有活性。Lecitase Ultra選擇性的詳細(xì)機制仍需闡明。

4、結(jié)論

利用單層技術(shù)，成功地表征了超乳糖酸酶對各種天然磷脂的底物特異性。在本研究中，除SM外，Lecitase Ultra對各種磷脂表現(xiàn)出廣泛的選擇性。在所有測試的磷脂中，觀察到對兩性磷脂PE的高度偏好。目前對Lecitase Ultra的研究為其底物選擇性提供了第一手信息，并為在原油脫膠或磷脂轉(zhuǎn)化過程中有效利用該酶提供了有利信息。

這項工作是由中國國家自然科學(xué)基金（31471690,31401627）、中國廣東省科技計劃（2013B0510000 09）和中國廣州珀爾里弗科技計劃（201610010074）提供的。作者聲明沒有利益沖突。

人物傳說

圖1不同磷脂的表面壓力-面積等溫線。

圖2使用不同磷脂的卵磷脂酶超水解活性隨表面壓力的變化。在室溫下，在零級槽中進行分析。緩沖液：50毫米檸檬酸緩沖液（pH值5.0）?；钚员硎緸閱挝粫r間、單位反應(yīng)室面積和“零級”槽中每毫升酶水解的底物摩爾數(shù)（摩爾數(shù)cm-2.min-1.mL-1）。